生物技术的应用:光合单细胞生物应用的可持续资源的利用
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2024-03-02
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«【·前言·】»
近年来,对光合单细胞生物作为生物技术应用的可持续资源的兴趣显著增加,逐渐扩大了微藻生物技术的范围,但也突出了其局限性。
主要缺点仍然是成本效益低,这阻碍了各种物质的大规模生产,为了使微藻技术具有商业竞争力,必须解决几个关键问题:
1.生产量和目标产品产量至少需要提高两倍;2.养殖系统(光生物反应器,开放式池塘)和污染控制的成本必须至少降低五倍,3.下游过程的成本,如生物质收获和产品提取,必须降低。
«【·生物资源·】»
大多数微生物被认为具有全球分布,像Cyanidiales这样的极端嗜微藻在特定和罕见的多极端环境中茁壮成长,而在其他地方,它们很容易被竞争。
这种栖息地的特殊性,以及它们突出的颜色,使得对氰菊进行集中采样成为可能,即使它们典型的极端栖息地,如酸性地热环境,可能很难在物理上和法律上进入。
环境适宜性似乎是限制氰菊发生的最重要因素,这导致对酸性异养或金属污染区域等进行进一步有针对性的取样,通过对模仿自然环境的人为地点进行采样,发现了Galdieria的新栖息地和地点。
氰菊属物种通常在田间共存,但是,可以根据其特定的生长条件单独分离它们,分离后,在模拟自然情况的条件下(酸性介质、高温和盐度)长期维护可抑制自养条件下污染物的生长。
因此,光养条件传统上用于轴烯和非轴烯氰菌株的长期维持,而光有机营养或异养条件仅适用于轴生保持。
潜在生产菌株的生物勘探可以基于新菌株的分离,这是一个相当耗时和资源消耗的过程,更有效和可持续的资源在于作为专门生物资源中心的公共和私人文化收藏。
将氰菊菌株用于商业规模生产时,评估其细胞特性、生产参数和下游加工的性质非常重要。
因此,氰化物可能不是理想的候选者:它只以光养方式生长,具有细胞壁,并且尚未进行基因改造。
«【·天然着色剂 热稳定性为优势·】»
近年来,天然色素和抗氧化剂受到食品和化妆品行业的广泛关注。
在这里,微藻被认为是这些化合物的宝贵来源,蓝色辅助色素藻蓝蛋白(C-PC)的商业生产是通过大规模培养节螺旋体(螺旋藻)属的蓝藻来实现的,现在已经进入了第四个十年。
目前C-PC的世界市场规模估计为30万美元,其中关节螺旋体是唯一的来源,除了在食品工业中作为天然着色剂的作用外,C-PC还可以在免疫测定中用作荧光探针。
因此,不依赖于防腐剂的热稳定藻蓝蛋白具有巨大的市场潜力。
总之,G. sulphuraria 和 C. merolae 都是热稳定 C-PC 的天然来源,是使用防腐剂治疗节螺旋体衍生的 C-PC 的有力替代品。
C-PC过表达C. merolae菌株的开发是除了在含有G. sulphuraria的封闭系统中进行光有机营养或异养生产之外的一种选择。
无论哪种方法,都需要进一步的研究和开发,以开发标准化操作并生产高质量的颜料。
«【·氰基梅罗拉作为生物燃料生产的模型·】»
近年来,微藻作为生物燃料的潜在资源越来越受到关注,与第一代和第二代生物燃料相比,微藻的优势在于它们的生物量产量高,并且能够在细胞内积累大量油(每单位干重50-65%)。
合适物种所需的特性包括对不断变化的环境因素(如光质量、温度和水质)的耐受性,以及对污染和病原体的抵抗力。
C. merolae代表了一种这样潜在的模式生物,其嗜热嗜酸性使其能够在大多数类型的培养系统中进行培养,包括开放、封闭、陆地、海洋、废水和补充工业废气的培养物。
16.5 Mb的小核基因组、遗传可追踪性、蛋白质表达系统的可用性和同源重组工具进一步增加了C. merolae作为生物燃料生产潜在模型的属性。
特别是,其高脂质含量和精确的脂质组成有助于藻类生物质的加工及其作为生物柴油、喷气燃料或其他生物燃料的利用。
基于比较基因组学,总共有121个基因被预测在C. merolae脂质代谢中发挥作用,结合蛋白质表达数据,可以生成梅罗拉C. merolae的脂质代谢图谱。
与真核和原核途径相反,C. merolae中的脂质生物合成通过一种新的偶联途径发生,其中单半乳糖基二酰基甘油前体棕榈酸和亚油酸分别由质体和内质网提供。
为了鉴定TAG积累中的限速步骤,测试了两种甘油-3-磷酸酰基转移酶CmGPAT1和CmGPAT2的过表达。
在正常细胞生长条件下,与野生型菌株相比,转基因梅罗拉菌株的TAG积累量高出59倍。
在其他藻类中,TAG积累已通过代谢工程增加,并被视为基于藻类生物柴油生产的菌株开发有希望的解决方案,所有这些数据共同支持C. merolae是生物燃料生产的有前途的模式生物。
然而,C. merolae的生长仍然太低,为了使其成为合适的生产菌株,有必要在菌株选择和生物量生产力方面进行进一步的尝试。
«【·表达平台极端微生物·】»
将光合作用与酶或途径的同源或异源实施相结合,以获得微藻中的天然产物,为绿色生物技术提供了巨大的机会。
对于几种微藻,遗传和代谢工程被证明,并为生产例如用于制药应用的生物活性化合物铺平了道路。
为了拥有一个最有用的生物生产系统,必须拥有一套广泛的分子遗传工具,这些包括将异源DNA引入宿主的方法,基因组编辑工具。
如CRISPR-Cas9,不干扰内源性基因功能的正交诱导和可抑制启动子,以及表征良好的基因和代谢物表达途径。
因此,基因工程的先决条件是了解各个微藻的基因组序列,嗜热红藻C. merolae和G. sulpharria因其许多有利的生长特性而被公认为绿色生物技术的潜在价值目标。
第一个完整的藻类基因组序列是C. merolae 10D,该序列揭示了5331条染色体上显着减少的20个基因,并对陆地植物和真核细胞的进化产生了独特的见解。
C. merolae的基因组大小约为16万个碱基对(bp)与面包酵母或裂变酵母相当,所有C. merolae基因中只有5.0%含有具有严格共识序列的剪接体内含子。
与内含子的缺乏一致,C. merolae具有一组显着减少的剪接体因子,除了核基因组外,还有C. merolae的线粒体和质体基因组序列。
低频率的内含子、单倍体基因组和细胞器DNA序列的可用性使C. merolae成为涉及基因改造的生物技术应用的绝佳靶标。
最初,比较基因组学是基于C. merolae基因组序列和一组EST硫磺G. sulphuraria。
如今,13年发表了7万bp的硫蕊G.p基因组序列迄今为止,已经有多个国家分离出了13 种氰菊菌株的全基因组。
包括源自 G. sulphuraria、G. phlegrea 和 C. merolae 类型材料的正宗菌株,测序物种之间的水平基因转移频率低(1%),这一发现可能对整个真核生物谱系产生影响。
然而,G. sulphhararia被证明含有5%的水平转移基因,并且通过RNA-seq分析,这些基因被确定为赋予多极端性状,如耐寒性和随之而来的碳代谢改变,甚至影响光合作用。
梅罗拉梭菌的整个基因组和细胞器DNA序列是可用的,因此,可以优化表达的异源靶基因的密码子使用,并且很容易定义通过同源重组进行基因整合的位点。
C. merolae拥有单倍体基因组,非常适合通过同源重组进行基因修饰,用突变版本替换野生型基因、改变启动子、引入异源基因或删除内源基因,核基因修饰已经确立。
为了获得稳定的转换,需要可选的标记,在酸性pH下生长微生物的一个潜在缺点是抗生素或其他小分子药物可能在培养基中降解。
最近有CDK抑制剂,并可能解释梅罗拉衣原体的一些明显抗生素耐药性,因此,最初对营养型菌株的适用性进行了表征。
内源性URA5.3基因已被用作尿嘧啶营养菌株M4中同源重组的可选标记,但目标位点的积分与URA5.3位点的积分竞争。
当使用Galdieria URA5.3基因作为标记时,这种竞争明显减少,具有完全URA5.3缺失的尿嘧啶营养素规避了URA5.3位点的整合问题。
而后,引入了梅罗拉梭菌的第二个选择标记,氯霉素乙酰转移酶或CAT,它可以稳定地整合到核基因组和叶绿体基因组中。
使用CAT标记,能够确定200 bp的侧翼同源性是DNA同源重组到基因组所需的最小值,但500 bp显着提高了重组效率。
然而,目前还没有一种稳定的基于质粒的梅氏梭菌表达载体,这将极大地促进这种红藻作为表达宿主的地位。
有了引入和选择异源DNA的方法,如何通过合适的启动子调节转基因的表达,已经确定了几个目标启动子。
鉴定出一种氮响应转录因子CmMyb1,该转录因子响应氮消耗而上调氮同化基因,CmMyb1通过结合几种启动子起作用,包括NRp,NRTp和NiRp,随后被证明是异源表达的有效调节因子。
类似地,发现含有CmHsp200基因启动子的20 bp区域可以可靠地诱导两种不同基因的表达,以响应温度向50°C以上的转变。
下调基因的两种方法是表达与目的基因互补的反义RNA,或者简单地通过选择性标记的同源整合来删除基因。
由于C. merolae缺乏RNAi机制,基因表达可以通过反义RNA的表达下调,如过氧化氢酶基因报道的那样。
总之,梅罗拉C. merolae中异源基因表达的基本工具是可用的,目前还没有合适的自我复制的梅氏梭菌质粒,以促进快速可靠的表达试验。
«【·氰菊开发的未来·】»
G. sulphuraria 和 C. merolae 在生物技术应用方面都具有独特的优势一方面是 Galdieria 生物质的有效生成,另一方面是对 C. merolae 基因组和遗传操作选择的先进理解。
很明显,这些生物的知识可以结合起来,如通过产生修饰的C. merolae菌株与来自G. sulphuraria的代谢物转运蛋白所显示的那样。
随着时间的推移,人们越来越认识到氰菊作为一种生物技术资源的潜力,然而,已经开发了用于生物质提取物的栽培程序、提取方案和验证,但仅适用于少数菌株。
公共和私人文化收藏品保存着500多种Cyanidiales菌株,在全球范围内从不同的栖息地分离出来。
这些珍贵的生物资源蕴藏着巨大的潜力,可以进一步推进为各种应用选择合适的菌株,最近启动了与细胞库和菌株开发有关的活动,这些活动对于建立生物技术进程是必不可少的。
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«【·前言·】»
近年来,对光合单细胞生物作为生物技术应用的可持续资源的兴趣显著增加,逐渐扩大了微藻生物技术的范围,但也突出了其局限性。
主要缺点仍然是成本效益低,这阻碍了各种物质的大规模生产,为了使微藻技术具有商业竞争力,必须解决几个关键问题:
1.生产量和目标产品产量至少需要提高两倍;2.养殖系统(光生物反应器,开放式池塘)和污染控制的成本必须至少降低五倍,3.下游过程的成本,如生物质收获和产品提取,必须降低。
«【·生物资源·】»
大多数微生物被认为具有全球分布,像Cyanidiales这样的极端嗜微藻在特定和罕见的多极端环境中茁壮成长,而在其他地方,它们很容易被竞争。
这种栖息地的特殊性,以及它们突出的颜色,使得对氰菊进行集中采样成为可能,即使它们典型的极端栖息地,如酸性地热环境,可能很难在物理上和法律上进入。
环境适宜性似乎是限制氰菊发生的最重要因素,这导致对酸性异养或金属污染区域等进行进一步有针对性的取样,通过对模仿自然环境的人为地点进行采样,发现了Galdieria的新栖息地和地点。
氰菊属物种通常在田间共存,但是,可以根据其特定的生长条件单独分离它们,分离后,在模拟自然情况的条件下(酸性介质、高温和盐度)长期维护可抑制自养条件下污染物的生长。
因此,光养条件传统上用于轴烯和非轴烯氰菌株的长期维持,而光有机营养或异养条件仅适用于轴生保持。
潜在生产菌株的生物勘探可以基于新菌株的分离,这是一个相当耗时和资源消耗的过程,更有效和可持续的资源在于作为专门生物资源中心的公共和私人文化收藏。
将氰菊菌株用于商业规模生产时,评估其细胞特性、生产参数和下游加工的性质非常重要。
因此,氰化物可能不是理想的候选者:它只以光养方式生长,具有细胞壁,并且尚未进行基因改造。
«【·天然着色剂 热稳定性为优势·】»
近年来,天然色素和抗氧化剂受到食品和化妆品行业的广泛关注。
在这里,微藻被认为是这些化合物的宝贵来源,蓝色辅助色素藻蓝蛋白(C-PC)的商业生产是通过大规模培养节螺旋体(螺旋藻)属的蓝藻来实现的,现在已经进入了第四个十年。
目前C-PC的世界市场规模估计为30万美元,其中关节螺旋体是唯一的来源,除了在食品工业中作为天然着色剂的作用外,C-PC还可以在免疫测定中用作荧光探针。
因此,不依赖于防腐剂的热稳定藻蓝蛋白具有巨大的市场潜力。
总之,G. sulphuraria 和 C. merolae 都是热稳定 C-PC 的天然来源,是使用防腐剂治疗节螺旋体衍生的 C-PC 的有力替代品。
C-PC过表达C. merolae菌株的开发是除了在含有G. sulphuraria的封闭系统中进行光有机营养或异养生产之外的一种选择。
无论哪种方法,都需要进一步的研究和开发,以开发标准化操作并生产高质量的颜料。
«【·氰基梅罗拉作为生物燃料生产的模型·】»
近年来,微藻作为生物燃料的潜在资源越来越受到关注,与第一代和第二代生物燃料相比,微藻的优势在于它们的生物量产量高,并且能够在细胞内积累大量油(每单位干重50-65%)。
合适物种所需的特性包括对不断变化的环境因素(如光质量、温度和水质)的耐受性,以及对污染和病原体的抵抗力。
C. merolae代表了一种这样潜在的模式生物,其嗜热嗜酸性使其能够在大多数类型的培养系统中进行培养,包括开放、封闭、陆地、海洋、废水和补充工业废气的培养物。
16.5 Mb的小核基因组、遗传可追踪性、蛋白质表达系统的可用性和同源重组工具进一步增加了C. merolae作为生物燃料生产潜在模型的属性。
特别是,其高脂质含量和精确的脂质组成有助于藻类生物质的加工及其作为生物柴油、喷气燃料或其他生物燃料的利用。
基于比较基因组学,总共有121个基因被预测在C. merolae脂质代谢中发挥作用,结合蛋白质表达数据,可以生成梅罗拉C. merolae的脂质代谢图谱。
与真核和原核途径相反,C. merolae中的脂质生物合成通过一种新的偶联途径发生,其中单半乳糖基二酰基甘油前体棕榈酸和亚油酸分别由质体和内质网提供。
为了鉴定TAG积累中的限速步骤,测试了两种甘油-3-磷酸酰基转移酶CmGPAT1和CmGPAT2的过表达。
在正常细胞生长条件下,与野生型菌株相比,转基因梅罗拉菌株的TAG积累量高出59倍。
在其他藻类中,TAG积累已通过代谢工程增加,并被视为基于藻类生物柴油生产的菌株开发有希望的解决方案,所有这些数据共同支持C. merolae是生物燃料生产的有前途的模式生物。
然而,C. merolae的生长仍然太低,为了使其成为合适的生产菌株,有必要在菌株选择和生物量生产力方面进行进一步的尝试。
«【·表达平台极端微生物·】»
将光合作用与酶或途径的同源或异源实施相结合,以获得微藻中的天然产物,为绿色生物技术提供了巨大的机会。
对于几种微藻,遗传和代谢工程被证明,并为生产例如用于制药应用的生物活性化合物铺平了道路。
为了拥有一个最有用的生物生产系统,必须拥有一套广泛的分子遗传工具,这些包括将异源DNA引入宿主的方法,基因组编辑工具。
如CRISPR-Cas9,不干扰内源性基因功能的正交诱导和可抑制启动子,以及表征良好的基因和代谢物表达途径。
因此,基因工程的先决条件是了解各个微藻的基因组序列,嗜热红藻C. merolae和G. sulpharria因其许多有利的生长特性而被公认为绿色生物技术的潜在价值目标。
第一个完整的藻类基因组序列是C. merolae 10D,该序列揭示了5331条染色体上显着减少的20个基因,并对陆地植物和真核细胞的进化产生了独特的见解。
C. merolae的基因组大小约为16万个碱基对(bp)与面包酵母或裂变酵母相当,所有C. merolae基因中只有5.0%含有具有严格共识序列的剪接体内含子。
与内含子的缺乏一致,C. merolae具有一组显着减少的剪接体因子,除了核基因组外,还有C. merolae的线粒体和质体基因组序列。
低频率的内含子、单倍体基因组和细胞器DNA序列的可用性使C. merolae成为涉及基因改造的生物技术应用的绝佳靶标。
最初,比较基因组学是基于C. merolae基因组序列和一组EST硫磺G. sulphuraria。
如今,13年发表了7万bp的硫蕊G.p基因组序列迄今为止,已经有多个国家分离出了13 种氰菊菌株的全基因组。
包括源自 G. sulphuraria、G. phlegrea 和 C. merolae 类型材料的正宗菌株,测序物种之间的水平基因转移频率低(1%),这一发现可能对整个真核生物谱系产生影响。
然而,G. sulphhararia被证明含有5%的水平转移基因,并且通过RNA-seq分析,这些基因被确定为赋予多极端性状,如耐寒性和随之而来的碳代谢改变,甚至影响光合作用。
梅罗拉梭菌的整个基因组和细胞器DNA序列是可用的,因此,可以优化表达的异源靶基因的密码子使用,并且很容易定义通过同源重组进行基因整合的位点。
C. merolae拥有单倍体基因组,非常适合通过同源重组进行基因修饰,用突变版本替换野生型基因、改变启动子、引入异源基因或删除内源基因,核基因修饰已经确立。
为了获得稳定的转换,需要可选的标记,在酸性pH下生长微生物的一个潜在缺点是抗生素或其他小分子药物可能在培养基中降解。
最近有CDK抑制剂,并可能解释梅罗拉衣原体的一些明显抗生素耐药性,因此,最初对营养型菌株的适用性进行了表征。
内源性URA5.3基因已被用作尿嘧啶营养菌株M4中同源重组的可选标记,但目标位点的积分与URA5.3位点的积分竞争。
当使用Galdieria URA5.3基因作为标记时,这种竞争明显减少,具有完全URA5.3缺失的尿嘧啶营养素规避了URA5.3位点的整合问题。
而后,引入了梅罗拉梭菌的第二个选择标记,氯霉素乙酰转移酶或CAT,它可以稳定地整合到核基因组和叶绿体基因组中。
使用CAT标记,能够确定200 bp的侧翼同源性是DNA同源重组到基因组所需的最小值,但500 bp显着提高了重组效率。
然而,目前还没有一种稳定的基于质粒的梅氏梭菌表达载体,这将极大地促进这种红藻作为表达宿主的地位。
有了引入和选择异源DNA的方法,如何通过合适的启动子调节转基因的表达,已经确定了几个目标启动子。
鉴定出一种氮响应转录因子CmMyb1,该转录因子响应氮消耗而上调氮同化基因,CmMyb1通过结合几种启动子起作用,包括NRp,NRTp和NiRp,随后被证明是异源表达的有效调节因子。
类似地,发现含有CmHsp200基因启动子的20 bp区域可以可靠地诱导两种不同基因的表达,以响应温度向50°C以上的转变。
下调基因的两种方法是表达与目的基因互补的反义RNA,或者简单地通过选择性标记的同源整合来删除基因。
由于C. merolae缺乏RNAi机制,基因表达可以通过反义RNA的表达下调,如过氧化氢酶基因报道的那样。
总之,梅罗拉C. merolae中异源基因表达的基本工具是可用的,目前还没有合适的自我复制的梅氏梭菌质粒,以促进快速可靠的表达试验。
«【·氰菊开发的未来·】»
G. sulphuraria 和 C. merolae 在生物技术应用方面都具有独特的优势一方面是 Galdieria 生物质的有效生成,另一方面是对 C. merolae 基因组和遗传操作选择的先进理解。
很明显,这些生物的知识可以结合起来,如通过产生修饰的C. merolae菌株与来自G. sulphuraria的代谢物转运蛋白所显示的那样。
随着时间的推移,人们越来越认识到氰菊作为一种生物技术资源的潜力,然而,已经开发了用于生物质提取物的栽培程序、提取方案和验证,但仅适用于少数菌株。
公共和私人文化收藏品保存着500多种Cyanidiales菌株,在全球范围内从不同的栖息地分离出来。
这些珍贵的生物资源蕴藏着巨大的潜力,可以进一步推进为各种应用选择合适的菌株,最近启动了与细胞库和菌株开发有关的活动,这些活动对于建立生物技术进程是必不可少的。
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